電泳篇開始

一、清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

二、灌膠與上樣

1. 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。

注意：可以用 1% 瓊脂糖在垂直電泳槽的左. 右和下部封邊，五分鐘后重復(fù)一次，這樣可以保證基本不漏膠。

2. 按前面方法配 10％ 分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用 10 ml 槍吸取 5 ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。

注意：灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要慢，否則膠會(huì)被沖變型。

3. 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等 3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

4. 按前面方法配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

注意：「濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠」其實(shí)說經(jīng)常有點(diǎn)過了，補(bǔ) 1～2 次就行了，不補(bǔ)膠問題也不大。

5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。

注意：沖洗的話個(gè)人感覺可以使用 5 ml 的針筒，當(dāng)然操作不能太粗暴了。

6. 測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含 20-50μl 蛋白（注意：根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量）的溶液體積即為上樣量。

取出上樣樣品** 200μl 的 EP 管中，加入 5×SDS 上樣緩沖液**終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過 15μl，加樣孔的**大限度可加 20μ 樣品，其實(shí)大一點(diǎn)的垂直電泳槽每孔**大上樣量可以達(dá)到 40μl，膠做得很好的話 50μ 也是問題不大的）上樣前要將樣品于沸水中煮 5-10 min 使蛋白變性。

本人心得：可以使用 PCR 儀進(jìn)行變性，加快速度，這樣就不用將水煮沸了，同時(shí)在水中煮蛋白樣品有下面弊端：1.EP 管容易炸開，樣品丟失。2. 容易進(jìn)水，使樣品體積增加，超過電泳**大上樣量。

7. 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液**少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插**加樣孔中緩慢加入樣品。

注：加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次，以免交叉污染

三、電泳

1. 電泳時(shí)間一般 4～5 h，電壓為 40 V 較好，也可用 60 V。

注：本人為了加快速度，濃縮膠時(shí)用 80-100 V 跑，到分離膠以后用 150-200 跑，結(jié)果也不錯(cuò)，總時(shí)間 2 h 左右。

2. 電泳**溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

注：如果目的條帶比較大的話，**好使用可視的蛋白 marker，F(xiàn)ermentas 的 0441 和 0671 比較好，就是有點(diǎn)貴。一般要讓目的條帶跑過分離膠的 1/3 比較好，不要局限于此說明。