Western 熒光檢測取決于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—顯影和定影效率這一系統(tǒng)。我的經歷認為確保萬無一失的做法是如果看到熒光則壓 10~30s，看不到則同時壓兩張，10~30 min 洗一張，如果無則再補一張,1 h 后洗。再無，則壓過夜。共 3 張片，根據(jù)每次結果調整。
其中兩張片子的壓法如下描述: 先剪一張比膜長 2~3 厘米的片子（以供貼膠帶），然后剪 2 片細小透明膠帶貼到片子的左右兩邊（貼時膠帶留一半用于粘到封口膜上），然后將片子壓到膜上，并使透明膠帶留出的一半粘到封口膜上。這樣就固定了**張膠片，就不會因為放、取第二張膠片而使**張移動了。然后放第二張膠片，與**張片子貼在一起就行，注意片子要干燥，壓片前用紙擦干封口膜，以避免被底物液體污染導致與下面一張粘在一起。取時用手輕輕拂過就可以把上面片子與下面一張錯開了，不要用手摳，否則下面一張也移動了。 在洗下面一張片子時一定要取掉粘在片子上的膠帶，否則在膠帶的地方會影響顯影。熒光經過下面一張膠片會稍微有些衰減，所以下面一張膠片感光稍微比上面一張強一些。
現(xiàn)象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解決
反影 (白色條帶, 黑色背景) ---- -- -1 HRP 過高 (背景較高) - - - - - - - - ---- - - - **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 1
顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色---- - -2 HRP 過高 (敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 2
信號弱或無---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP 過高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗體-抗原系統(tǒng)敏感性過低- --- - - - - - - 提高抗體濃度/蛋白上樣量*注 4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 轉膜不充分/過轉- -- -- - - -- - - - - ---- -優(yōu)化轉膜條件*注 5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP 或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----測試活性或選用敏感底物 *注 6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 過高 (背景較高) - -- - - - - - - - - - -- **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封閉時間不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延長封閉時間 4 度過夜**好*注 8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗體與封閉液有交叉----- - - - - - - - - - -更換封閉液 (如 3%BSA 的 TBST)*注 9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST 洗脫不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脫時間、次數(shù)、用量*注 10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光時間過長 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光時間*注 11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗體濃度過高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗體濃度或蛋白上樣量*注 12
條帶內無顯影的白點----------------13 轉膜不良（如有氣泡在膠-膜之間) -- -- 精細操作*注 13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按說明書平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜*注 14
---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜與 X 光片間有氣泡- -- - - - - - - - - - --顯影前去除氣泡*注 15
非特異性條帶- - - - - --------- -- - -16 抗體交叉反應- - - - - - - - - - - -- -- - --**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 16
- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS 非特異性結合蛋白條帶 - - --- - ---使用無 SDS 轉膜液*注 17
散在小圓斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封閉液有雜質顆粒- -- - --------- ------- 靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層*注 18
*注 1 其具體問題有二：一是背景較高, 二是沒有條帶. 形成機制為條帶處 HRP 很快將底物耗竭，則不發(fā)光不使膠片感光而為白色, 周圍因背景 HRP 較低而持續(xù)發(fā)光一段時間使膠片感光為黑色。這種常見于高濃度抗體并且封閉/洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因 3 的現(xiàn)象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶處為暗。如是則要么通過降低抗體解決，要么動作迅速早期未耗竭底物時壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時間不能解決問題。也可以過一段時間鼿 RP 稍減后重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是原因 3 的現(xiàn)象。其分析和解決同上。
*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的產物使膜發(fā)黃, 壓出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的現(xiàn)象同時存在，只是一種現(xiàn)象，在壓過的膜可以看出來（只在加底物后一段時間出現(xiàn)，幾小時后可能還會消退，有時甚**剛加底物 1~2 min 就可以看出來，所以要把握時機）。如果沒有達到原因 1 和原因 3 的程度，那么這種情況一定能夠看到很強的熒光，是一種良好的狀態(tài), 是我們所期盼的。如果壓出正常片子而不出現(xiàn)原因 1 和原因 3 的現(xiàn)象, 可以不予處理。但因為熒光太強極易導致條帶增粗變大，所以也可以不稀釋抗體而通過調整壓片時間來解決，一般壓 10s~30s，甚**可以 3~5s，即時根據(jù)結果在暗室調整, 熒光持續(xù)時間長的話都可連續(xù)壓十數(shù)張片子而效果良好。但也有這種情況，就是由于 HRP 過強無論怎么減少壓片時間條帶都依然粗大（如果時間過短如<3s則可因感光不足導致條帶太淡，這樣就不可取了，但依然是粗大的、非條帶的本來面目），那么如果想獲得漂亮條帶則必須通過降低抗體濃度（減少上樣量很不穩(wěn)定且能力有限，故很少使用）來解決。原因1和3若如是則解決也是一樣的。#p#分頁標題#e#
*注3 這是與1類似但抗體特異性較好時的一種表現(xiàn)，經常與下面的原因4、5、6混淆，特別需要注意。主要出現(xiàn)在HRP極高的情況下，來不及壓片就已耗竭底物，往往伴有原因2的現(xiàn)象。可通過加入底物后迅速進入暗室觀察熒光確定，也可以根據(jù)原因2的現(xiàn)象確定，以區(qū)分于原因4、5、6。除非動作迅速早期未耗竭底物時壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時間不能解決問題。也可以過一段時間待HRP稍減后TBST簡單洗膜重新加底物壓片。這種情況下一/二抗稀釋可高達 10 倍而依然熒光明顯。
*注4 提高抗體上樣量以及下述的使用敏感底物/延長壓片時間比較簡單, 在此不贅述，只提醒一下隨抗體濃度增高背景和非特異性可能會增加。關于上樣量的極限在此發(fā)表我的看法：對于裂解的混合蛋白以上樣孔底面積(平方毫米)乘30ug作為極限上樣量，而落實到每一個具體條帶（同一分子量的所有蛋白或僅做單一蛋白電泳），則以0.3ug/平方毫米底面積作為極限上樣量。(見《抗體技術實驗指南》的免疫印跡一章)，超過此量可能會導致條帶變形。條帶信號弱可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長壓片時間解決。但實際上樣量的極限并不以我說的極限上樣量為準，因為這個極限上樣量是確保所有分子量的條帶都跑的很漂亮的極限, 而上樣超量的表現(xiàn)是隨量的加大變形的條帶由低分子量逐漸往高分子量延伸。所以western極限上樣量的真正操作標準是以目的條帶不變形作為極限。比如對于150kd，完全可以超出我所說的極限上樣量的2倍而不變形（此時中低分子量條帶早已融合或擠為棒槌形了）
*注5 對于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不會出現(xiàn)過轉情況，轉膜不充分是主要原因，增加轉膜力度無非是加大電壓/電流，延長時間。但對于小分子蛋白（<30kd 就要注意了，<15kd 尤其要當心）很可能出現(xiàn)過轉，麗春紅染膜或觀察 marker 有沒有穿膜可以確認，沒有麗春紅也可以考染轉膜后的膠，如果是一片空白，則要小心了，可適當降低轉膜力度。對于低分子量一般轉膜液不要加 SDS 以防過轉，《抗體技術實驗指南》提供的針對中低分子量的濕轉緩與高分子量的相比也是不含 SDS 的。
*注 6 測試 HRP 或底物活性：于暗室 EP 管加底物 A、B 液各 500ul，加入 1ul HRP 偶聯(lián)二抗，若底物立即發(fā)出藍光并于隨后數(shù)分鐘內消失說明 HRP 和底物尚好。此外試劑公司還開發(fā)一些超級底物，其敏感度可達到 pg 級，但價格昂貴，對某些表達較低的蛋白效果會好些，而且也超級省抗體（其推薦抗體稀釋比高達1:10,000 以上）。我用的是敏感度為 ng 級的底物，大部分 western 都還可以，pg 級的還放在手里，沒舍得用。
*注 7 高背景原因是因為 HRP 偶聯(lián)二抗結合到膜上，其原因包過直接結合、通過膜上蛋白間接結合、通過一抗（主要指多抗中的雜抗體）間接結合、通過封閉物（與封閉物交叉反應）間接結合、洗脫不徹底等原因造成的。在稀釋抗體降低背景的同時也會降低對目的蛋白的結合效率，意即以犧牲信號強度為代價。不過在此提出另外一種和稀釋抗體恰相反的做法——提高抗體濃度。這種辦法適用于 HRP 結合到膜上較多而且底物相對極其敏感（如 pg 級底物，因極其敏感可把結合到膜上的極其微量抗體產生的背景也顯示出來，而這種背景在 ng 級底物即使壓片過夜也沒有顯示），無論如何稀釋抗體和加強洗膜都不能消除背景或者條帶和背景隨稀釋呈等比例遞減甚**條帶遞減速度比背景還快，如果稀釋抗體則壓片時間需延長而背景反而因此更加明顯。這種情況下認為需要提高抗體含量以提高條帶顯示程度，而背景隨抗體濃度提高并不加強的很厲害，如是則可以通過減少壓片時間而達到突出條帶降低背景的目的（我**近帶一個研究生使用 pg 級超級底物時發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象并使用此方法解決背景高的難題，當時一抗稀釋為原來的 4 倍，二抗稀釋為原來的 10 倍，即總稀釋為原來的 40倍仍然可以看到背景的熒光但條帶的熒光卻減了許多導致條帶和背景都無法區(qū)分了，后來回復原來濃度并稍微延長孵育時間則條帶熒光明顯蓋過背景并減少壓片時間** 5s 解決）。
*注 8 這一點似乎多數(shù)人都不重視，所以有時候會有些意外。我一般室溫 2~4 h，但 4 度過夜確實是**好的。另外在平皿中搖似乎比封口膜更容易掌握并獲得較好的效果，對新手似乎更好。
*注 9 實際上牛奶對于多數(shù)抗體來說還是很好的，但所有二抗也都寫著：與牛奶可能有交叉反應。BSA 蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。單用 TBST 也可以，此法雖然減少了交叉，但單就封閉能力而言卻也因此而降低。
*注 10 一般 10 min*3 次就足夠了，如果不放心可按自己意志加強時間、次數(shù)、洗脫液用量。
*注 11 以犧牲敏感度為代價其**低標準是使目的條帶能夠正常顯影，對一切原因有效，但效果局限。
*注 12 以犧牲敏感度為代價其**低標準是使目的條帶能夠正常顯影，僅對膜上蛋白和一抗引起的有效。
*注 13 主要是氣泡在膠-膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達膜上，這一步在操作時尤其要小心，我自己犯過，也看到其他人犯過。我的辦法是把膠鋪到膜上，先使其一邊接觸膜的一邊，這樣就會在膠和膜交界的地方形成一個水相前緣，然后慢慢落下凝膠，這樣這個水相前緣就會逐漸推進直**膠膜重合，如是則不會有氣泡產生。把膠鋪到膜上而非相反是因為膠是透明的，可以看到水相前緣以及有無氣泡產生。#p#分頁標題#e#
*注 14 膜平衡不均或有油脂污染的表現(xiàn)是膜上有疏水的通明色和蛋白幾無（麗春紅染），這點并不多見。
*注 15 這一點我是抄 pierce 的說明書的，我沒遇到過，膜與 X 光片間有氣泡也不影響熒光通過，這個我可以肯定。似乎不透明的東西才會導致。
*注 16 非特異性條帶在普通多抗比較多見，純化多抗會好的多，但單抗也不是**沒有，我也遇到過。關于 wetern 的抗體選擇在此提出我的觀點：**理想的是混合單抗，其次是純化多抗，單抗和多抗各有局限和特點，根據(jù)個人對特異性需求和蛋白的穩(wěn)定性而定。
考慮的參數(shù)主要是抗原表位和特異性兩個因素，不包含每個抗體價格。混合單抗雖然針對多個表位但代價太高，需購置多個單抗然后混合，很少有人這么做。純化多抗基本具有混合多抗的性質和優(yōu)點，表位多，穩(wěn)定性好，特異性也不差，我覺得是實際中的**。單抗雖然特異性好，但如果其針對的表位在提取蛋白時被破壞則其敏感度為會下降甚**為 0，故不穩(wěn)定。普通多抗雖然表位多，但因含其他抗體，特異性差了好多，會有很多雜帶乃**背景。實際我做的抗體多數(shù)都是普通多抗，只要封閉的好，效果還是很不錯的；單抗雖說不穩(wěn)定，但實際中我都能做出來，尤其是內參，強烈推薦只選單抗。
*注 17 此點我根本不知道，完全是拷貝 pierce 說明書的。
*注 18 主要原因是牛奶里面會有一些不懸浮的大顆粒，這些東西對封閉無益。我所有的牛奶全是配好后在 4 度靜置（**好放在尖底的管子內），這樣那些大顆粒就會沉淀到底部，吸取時不要擔心牛奶不均而特意混勻，我只吸上面的，下面的顆粒則不要取。如是則在也沒有遇到這種現(xiàn)象。不推薦過濾牛奶，因為耗時極長且得率極低。我用過幾次但后來廢棄了這種做法。
