暗室實(shí)驗(yàn)
暗室實(shí)驗(yàn)的操作流程:
1. 新鮮配制1-2ml工作液(A液與B液1:1或1:40混合配制)
2. 進(jìn)入暗室,在黑暗的條件下,加入1μl未稀釋的二抗(HRP連接物)
3. 混合后,可立即在暗室中觀察到藍(lán)色光
暗室實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):
工作液按正確比例混合,且新鮮配制
在暗室中加入二抗
直接使用未稀釋的二抗
加入二抗后,立即觀察
注:暗室實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)底物是否有活性,以及二抗是否有活性。
如果暗室實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性:
更換其它二抗,再次進(jìn)行檢測(cè);再次檢測(cè)結(jié)果仍為陰性,證明底物喪失活性。
暗室實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性:
認(rèn)為二抗及底物活性良好; Western Blot 系統(tǒng)需要進(jìn)一步優(yōu)化
優(yōu)化抗原和抗體濃度的斑點(diǎn)雜交方法:斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度
對(duì)于一個(gè)給定的抗原,**佳的抗體濃度依賴的抗原和抗體本身。抗原和抗體的親和力,以及一抗與二抗的特異反應(yīng)都是不同的。**優(yōu)抗原和抗體濃度可通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的抗原和抗體作用確定。另外,更快和更簡(jiǎn)單的方法是進(jìn)行斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)。以下是使用超敏感信號(hào)底物進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡的操作方法。
注:所有的抗體稀釋度假定起始濃度為1 mg/mL。
1. 用TBS 和PBS 稀釋的蛋白樣品,好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的,但是由于抗原的濃度是未
知的, 所以有必要進(jìn)行寬范圍的稀釋度的檢測(cè)。SuperSignal West Pic 化學(xué)發(fā)光底物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)皮g 水平,所以樣品的稀釋范圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過(guò)多的抗原,結(jié)果會(huì)出現(xiàn)以下情況:非特異性條帶、模糊條帶和信號(hào)降低。
2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印膜。所需膜的數(shù)量依賴于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常,一種或兩種一抗的稀
釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進(jìn)行測(cè)定的。例如:1/1000 的一抗和1/50000 的二抗;1/1000 的一抗和1/100000 的二抗;1/5000 的一抗和1/50000 的二抗;以及1/5000 和1/100000 的二抗。
3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點(diǎn)在膜上。用盡可能小量的稀釋液點(diǎn)在膜上(2-5 ul 為宜),因?yàn)橛玫捏w積越大,信號(hào)越彌散。抗原溶液在膜上干10-30 分鐘或直**無(wú)可見的水分。
4. 用含0.05%的Tween-20 封閉液封閉膜上的非特異性點(diǎn),室溫震蕩孵育1 h。
5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20 去污劑中,并加到膜上,室溫震蕩孵育1h。
6. 用TBS 或PBS 洗膜4-6 次,用盡可能大體積的洗脫液,在洗脫液中加入0.05%的吐溫,用以減少非特異背景。每次洗脫過(guò)程中,使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5 分鐘,倒出洗脫液并重復(fù)。孵育前,在洗脫液中短時(shí)間的漂洗可能會(huì)增加洗脫效率。
7. 制備二抗/HRP 結(jié)合的封閉試劑/Tween-20 去垢劑稀釋液,將二抗稀釋液加到膜上震蕩孵育1 h。
8. 按第6 步方法再次清洗膜。
9. 準(zhǔn)備底物工作緩沖液,混合等體積的魯米諾/增強(qiáng)劑和穩(wěn)定的過(guò)氧化物溶液。制備足夠體積確保印跡點(diǎn)完全濕潤(rùn),保證印跡點(diǎn)在孵育過(guò)程中不會(huì)干。推薦體積:0.1 ml/cm2印跡面。
10. 將膜在超感應(yīng)顯色底物工作液中孵育5 分鐘;
11. 將膜從底物上移除,放到塑料布或其它防護(hù)膜上;
12. 將印跡貼到膠片上,在蛋白旁邊曝光。任何標(biāo)準(zhǔn)的或者增強(qiáng)的放射自顯影膠片都可以用。推薦**次曝光30-60 s,為得到**佳結(jié)果,曝光時(shí)間可不同。另外,也可用CCD 相機(jī)或其它成像設(shè)施;然而這些設(shè)施可能需要更長(zhǎng)的曝光時(shí)間。
13. 在**佳的印跡膜上,超感應(yīng)反應(yīng)底物產(chǎn)生的信號(hào)可能會(huì)持續(xù)超過(guò)8 h。未獲得**佳結(jié)果,印跡能重復(fù)曝光到膠片上或者成像系統(tǒng)中。隨印跡時(shí)間的延長(zhǎng),需延長(zhǎng)曝光時(shí)間。如果未得到**佳結(jié)果,可用抗原和/或抗體稀釋液重復(fù)進(jìn)行這個(gè)程序。