暗室實(shí)驗(yàn)
暗室實(shí)驗(yàn)的操作流程：
1. 新鮮配制1-2ml工作液（A液與B液1:1或1:40混合配制）
2. 進(jìn)入暗室，在黑暗的條件下，加入1μl未稀釋的二抗（HRP連接物）
3. 混合后，可立即在暗室中觀察到藍(lán)色光



暗室實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：
工作液按正確比例混合，且新鮮配制
在暗室中加入二抗
直接使用未稀釋的二抗
加入二抗后，立即觀察
注：暗室實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)底物是否有活性，以及二抗是否有活性。

如果暗室實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性：
更換其它二抗，再次進(jìn)行檢測(cè)；再次檢測(cè)結(jié)果仍為陰性，證明底物喪失活性。

暗室實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性：
認(rèn)為二抗及底物活性良好； Western Blot 系統(tǒng)需要進(jìn)一步優(yōu)化
優(yōu)化抗原和抗體濃度的斑點(diǎn)雜交方法：斑 點(diǎn) 雜 交 方 法——優(yōu) 化 抗 原 和 抗 體 濃 度

對(duì)于一個(gè)給定的抗原，**佳的抗體濃度依賴的抗原和抗體本身。抗原和抗體的親和力，以及一抗與二抗的特異反應(yīng)都是不同的。**優(yōu)抗原和抗體濃度可通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的抗原和抗體作用確定。另外，更快和更簡(jiǎn)單的方法是進(jìn)行斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)。以下是使用超敏感信號(hào)底物進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡的操作方法。
注：所有的抗體稀釋度假定起始濃度為1 mg/mL。
1. 用TBS 和PBS 稀釋的蛋白樣品，好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的，但是由于抗原的濃度是未
知的， 所以有必要進(jìn)行寬范圍的稀釋度的檢測(cè)。SuperSignal West Pic 化學(xué)發(fā)光底物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)皮g 水平，所以樣品的稀釋范圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過(guò)多的抗原，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)以下情況：非特異性條帶、模糊條帶和信號(hào)降低。
2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印膜。所需膜的數(shù)量依賴于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常，一種或兩種一抗的稀
釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進(jìn)行測(cè)定的。例如：1/1000 的一抗和1/50000 的二抗；1/1000 的一抗和1/100000 的二抗；1/5000 的一抗和1/50000 的二抗；以及1/5000 和1/100000 的二抗。
3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點(diǎn)在膜上。用盡可能小量的稀釋液點(diǎn)在膜上（2-5 ul 為宜），因?yàn)橛玫捏w積越大，信號(hào)越彌散。抗原溶液在膜上干10-30 分鐘或直**無(wú)可見的水分。
4. 用含0.05%的Tween-20 封閉液封閉膜上的非特異性點(diǎn)，室溫震蕩孵育1 h。
5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20 去污劑中，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h。
6. 用TBS 或PBS 洗膜4-6 次，用盡可能大體積的洗脫液，在洗脫液中加入0.05%的吐溫，用以減少非特異背景。每次洗脫過(guò)程中，使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5 分鐘，倒出洗脫液并重復(fù)。孵育前，在洗脫液中短時(shí)間的漂洗可能會(huì)增加洗脫效率。
7. 制備二抗/HRP 結(jié)合的封閉試劑/Tween-20 去垢劑稀釋液，將二抗稀釋液加到膜上震蕩孵育1 h。
8. 按第6 步方法再次清洗膜。
9. 準(zhǔn)備底物工作緩沖液，混合等體積的魯米諾/增強(qiáng)劑和穩(wěn)定的過(guò)氧化物溶液。制備足夠體積確保印跡點(diǎn)完全濕潤(rùn)，保證印跡點(diǎn)在孵育過(guò)程中不會(huì)干。推薦體積：0.1 ml/cm2印跡面。
10. 將膜在超感應(yīng)顯色底物工作液中孵育5 分鐘；
11. 將膜從底物上移除，放到塑料布或其它防護(hù)膜上；
12. 將印跡貼到膠片上，在蛋白旁邊曝光。任何標(biāo)準(zhǔn)的或者增強(qiáng)的放射自顯影膠片都可以用。推薦**次曝光30-60 s，為得到**佳結(jié)果，曝光時(shí)間可不同。另外，也可用CCD 相機(jī)或其它成像設(shè)施；然而這些設(shè)施可能需要更長(zhǎng)的曝光時(shí)間。
13. 在**佳的印跡膜上，超感應(yīng)反應(yīng)底物產(chǎn)生的信號(hào)可能會(huì)持續(xù)超過(guò)8 h。未獲得**佳結(jié)果，印跡能重復(fù)曝光到膠片上或者成像系統(tǒng)中。隨印跡時(shí)間的延長(zhǎng)，需延長(zhǎng)曝光時(shí)間。如果未得到**佳結(jié)果，可用抗原和/或抗體稀釋液重復(fù)進(jìn)行這個(gè)程序。