一、 目的
建立SDS-PAGE電泳的測(cè)定方法,確保電泳檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保證電泳的安全性、有效性。
二、 范圍與權(quán)責(zé)
適用于本公司的所有成品以及中間體的分析，由化驗(yàn)員負(fù)責(zé)采樣檢測(cè)。 品控主管負(fù)責(zé)審核。
三、 原理
SDS-PAGE電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS,SDS會(huì)與變性的多肽結(jié)合，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw為分子量；X為遷移率；k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)數(shù)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。
四、 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
1. DYCZ-24DN 雙垂直
電泳儀 2. DYY-8C
電泳儀電源
3. STS-2A
脫色搖床（水平） 4. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 5. 平皿：直徑150mm 6. TEMED:四甲基乙二胺 7. DTT:二硫蘇糖醇 8.
儲(chǔ)存液
①2M Tris-HCl緩沖液：稱取24.2g Tris，用50ml蒸餾水溶解后，滴加HCl調(diào)節(jié)pH**8.8，待室溫，加蒸餾水**100ml。
②1 M Tris-HCl緩沖液：稱取12.1g Tris，用50ml蒸餾水溶解后，滴加HCl調(diào)節(jié)pH**6.8，待室溫，加蒸餾水**100ml。
③10%SDS溶液：稱取10g SDS ，加蒸餾水溶解**100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸餾水，混合均勻。
⑤1%溴酚藍(lán)：100mg溴酚藍(lán)，加蒸餾水**10ml，攪拌**完全溶解，水相針式過(guò)濾器過(guò)濾除去聚合的染料。 9. 工作液
①A液：30%丙烯酰胺儲(chǔ)存液，丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，可通過(guò)皮膚被人體吸收并富集。操作時(shí)要避免皮膚接觸，并帶合適的口罩于通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
②B液—分離膠緩沖液：取75ml 2M Tris-HCl緩沖液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸餾水，混合均勻，4℃保存數(shù)月。
③C液—濃縮膠緩沖液：取50ml 1M Tris-HCl緩沖液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸餾水，混合均勻，4℃保存數(shù)月。
④10%APS：稱取1g過(guò)硫酸銨，加10ml蒸餾水溶解后，水相針式過(guò)濾器過(guò)濾分裝到EP管中，4℃保存一個(gè)月，-20攝氏度保存一年。 ⑤上樣緩沖液：稱取0.154g DTT，于10ml容量瓶中，加少量水溶解后，加 0.6ml 1 M Tris-HCl緩沖液，5ml 50%的甘油，1ml 1%溴酚藍(lán)，混合均勻后定容**刻度線。
可分裝**EP管保存，4℃保存一個(gè)月，-20攝氏度保存一年。
⑥電極緩沖液：稱取3g Tris，14.4g Gly，1g SDS**1L燒杯中，加1L蒸餾水溶解，攪拌均勻，室溫保存。
10. 染色液：稱取1g考馬斯亮藍(lán)R-250，加450ml乙醇，加100ml乙酸，加水450ml，混合均勻，室溫保存。
11. 脫色液：100ml乙醇，加100ml冰醋酸，加水800ml，混合均勻，室溫保存。
五、 操作步驟
①將平板玻璃和凹板玻璃重疊，用手將兩塊玻璃板在桌面上或是玻璃板上豎起，使兩玻璃底面平齊，從而形成膠室。
②將膠室放入主體，是凹玻璃的一面向內(nèi)。若做單面膠，另一側(cè)用單膠堵板（δ=5mm）代替。 ③插入楔形插板，用力向下按，擠緊玻璃板。
④將主體放入原位制膠器內(nèi)，手柄起立位與底座箭頭對(duì)齊，兩手同時(shí)把手柄向主體推動(dòng)，直到推不動(dòng)為止，然后開(kāi)始旋轉(zhuǎn)手柄，聽(tīng)到咔、咔兩聲，底座箭頭指向手柄1.0mm標(biāo)志處，此時(shí)楔形插板已壓緊膠室，可以開(kāi)始灌膠了。 2、分離膠的配制
按上表，將A液，C液，蒸餾水先加到小燒杯中，混合均勻，再添加10%APS,TEMED后，混合均勻，迅速連續(xù)灌到分離膠頂部，直**有膠溢出，隨即插入試樣格，在室溫或恒溫箱內(nèi)垂直放置10min，靜置直**完全聚合。 4、樣品的處理
將樣品與上樣緩沖液以4：1混合均勻，在金屬浴上100℃，10min，如有沉淀，可適當(dāng)離心備用。 5、加樣
①在凝膠聚合后，向相反的方向擰手柄，手柄彈出。 ②將電泳儀主體從原位制膠器上取出放入電泳儀下槽中。
③將約140ml的電泳緩沖液倒入由膠室和主體形成的上槽中，使緩沖液沒(méi)過(guò)凹玻璃板。
④將約200ml的電泳緩沖液倒入下槽中 ⑤慢慢地將試樣格垂直拔出。
⑥將處理好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測(cè)蛋白樣品，按預(yù)定順序通過(guò)緩沖液小心的添加5~10μl到每個(gè)樣品孔中。 6、電泳
蓋好
電泳槽蓋，接通電泳儀電源與電泳儀之間的電泳導(dǎo)線，設(shè)定電壓為60V，電泳時(shí)間約為30min，直**溴酚藍(lán)指示帶經(jīng)過(guò)濃縮膠與分離膠的分界線后，設(shè)定電壓100v，電泳時(shí)間150min，直**溴酚藍(lán)指示帶接近分離膠底部，切斷電源，電泳完畢。 7、剝膠
卸下電泳膠板，用刮刀小心撬開(kāi)玻璃板，使兩者分離，切除凝膠左下角以示標(biāo)記。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
8、染色
從玻璃板上，將凝膠小心的整塊刮到裝有染色液的平皿中，置于搖床上染色45r/min，1h。 9、脫色
從染色液中小心取出凝膠，注意不要弄破，用蒸餾水清洗幾次，轉(zhuǎn)移到裝有脫色液的平皿中，置于搖床上脫色45r/min，根據(jù)脫色情況更換脫色液，脫色過(guò)夜。 脫色后，可將凝膠拍照保存，或是將凝膠浸于水中保存一段時(shí)間。
10、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)量染料和蛋白質(zhì)區(qū)帶移動(dòng)的距離，即從分離膠電泳起始**染料區(qū)帶孔洞及蛋白質(zhì)區(qū)帶中心位
置的距離。
11、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
縱軸為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)，橫軸為對(duì)應(yīng)的遷移率，可得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，即可根據(jù)
遷移率測(cè)出未知蛋白的分子量。
六、 問(wèn)題分析與解決辦法
1、“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
主要是凝膠中部凝固不均勻?qū)е?，多?jiàn)于比較后的凝膠中。可以使其充分混合均勻后制膠，待其凝固完全后，再做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2、拖尾、紋理現(xiàn)象的產(chǎn)生？
只要是樣品的溶解效果不好，有顆粒存在，可以加樣前離心一下；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制。
